聚合酶鏈反應(yīng)改良技術(shù)及其用途
時間：2005-05-11
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董瑩 云南省瘧疾防治研究所 云南思茅 665000
全文發(fā)表于《中國寄生蟲病防治雜志》2001年14卷1期61-63頁
80年代中期出現(xiàn)了一種新技術(shù)，稱為聚合酶鏈反應(yīng)( P0lymerase chain reation，PCR)，其基本原理是在目的基因的兩端人工合成兩段寡核苷酸引物，在提取于水生嗜熱菌中的DNA聚合酶TaqI作用下，以溶液中4種脫氧核苷酸為原料，以待測的目的基因為模板，在人工控制的變性溫度、復(fù)性溫度及延伸溫度條件下，于短期內(nèi)完成目的基因的體外擴增。PCR技術(shù)誕生之初最基本的用途之一是基因診斷。最近隨著分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)的進步、針對PCR系統(tǒng)中模板取材、引物設(shè)計的改良及PCR產(chǎn)物的不同運用，PCR技術(shù)及其用途被多層面、全方位地發(fā)展了，從而也顯示了PCR技術(shù)在生命科學(xué)不同領(lǐng)域中運用的強大功能。本文首先就普通PCR 技術(shù)在各環(huán)節(jié)的革新方式作一簡介，再例舉不同PCR改良技術(shù)在各研究領(lǐng)域的運用。
一、針對PCR技術(shù)各環(huán)節(jié)的革新措施
1、引物的改良 引物的設(shè)計和選擇是PCR技術(shù)的重要部分，直接關(guān)系到PCR的敏感性和特異性，通常需要了解基因背景信息而設(shè)計合成引物。隨著所合成引物可裁信息量的增加，引物的職能也在不斷增加，除了引導(dǎo)脫氧核糖核酸按模板限定聚合外，還可制造出特定的結(jié)構(gòu)以便PCR 產(chǎn)物進一步用于基因片段克隆及或基因突變位點的鑒定。如對裂殖子表面蛋白1的17區(qū)基因片段(MSP1-17)的PCR擴增，其引物設(shè)計時，在正向引物上設(shè)計有Sal l限制性內(nèi)切酶位點及起始碼，反向引物上設(shè)計有BamH I限制性內(nèi)切酶位點及終止碼，由這對引物引導(dǎo)合成的DNA片段屬于MSP-17 基因， 經(jīng)Sal I和BamH I雙酶切后的回收片段能與被同樣雙限制性內(nèi)切酶切的puc18質(zhì)粒載體重組。此處的引物的所含的4個功能序列為最終得到MSP1-17基因片段的克隆提供了便利。又如，對惡性瘧原蟲二氫葉酸還原酶(DHFR) 基因進行多態(tài)研究時， 所用PCR 引物F/3′末端以個別堿基替換的機制生成了Dra I限制性內(nèi)切酶位點， 通過相應(yīng)限制點性內(nèi)切酶切后能靈敏地檢測出該164號密碼子為編碼異亮氨基酸多態(tài)。又如，為了能直接從PCR擴增產(chǎn)物的指紋圖鑒定惡性瘧原蟲多藥抗性基因(Pfmdr1)片段的多態(tài)性，使DCW3引物3′末端的堿基以替換方式產(chǎn)生TAT序列，帶該3 ′末端序列的引物只能擴增可與該引物產(chǎn)生全面互補、且含酪氨酸編碼序列多態(tài)的Pmdr1基因， 從而對PCR產(chǎn)物的電泳分析就能鑒別酪氨酸編碼的存在。另外，在PCR引物末端帶上某種配體，以便PCR通過配體結(jié)合機制與別的系統(tǒng)聯(lián)結(jié)，如擴增惡性瘧原蟲SSUrRNA基因序列中瘧原蟲種特異保守序列的引物5′末端結(jié)合有生物素， 帶有生物素的PCR產(chǎn)物與包被在聚乙氯烯板上的親和素結(jié)合，結(jié)合體可在熒光素標記的寡核苷酸探針介導(dǎo)下與ELISA系統(tǒng)相接。這種對引物的改良所建立的有PCR參予的系統(tǒng)其敏感性、特異性均高于一般PCR。
2、不同取材的模板 作為PCR擴增模板的DNA片段，通常是基因內(nèi)的保守序列，以此DNA片段為模板的PCR擴增多只適用于基因診斷。隨后由于對PCR技術(shù)的精確把握，人們可用mRNA模板經(jīng)PCR技術(shù)建立cDAN文庫，也能由已知的多肽分子經(jīng)PCR技術(shù)克隆該多肽分子的基因，如由已知多肽氨基末端序列反推出這部分相應(yīng)的基因序列，并據(jù)此指導(dǎo)mRNA-5′末端的引物合成，同時依據(jù)mRNA-3′末端多聚腺苷酸(poly-A) 序列指導(dǎo)合成多聚胸苷酸(poly-T)的引物，繼而用PCR技術(shù)在上述引物的引導(dǎo)下從制備細胞的mPNA中合成出相應(yīng)的cDNA，再依據(jù)引物設(shè)計時的酶切位點，將該cDNA克隆可表達載體中，進一步做基因研究或基因產(chǎn)物表達。為了建立DNA片段庫，人們甚至可以用人工隨機合成的核苷酸片段作為PCR擴增的模板，如俞乃昌等經(jīng)人工合成的3′-17bp接25個隨機核苷酸接20 bp-5′寡核苷酸列為模板，用互補于3′末端及5′末端的引物T7、Rev經(jīng)PCR擴增得108 bp的雙鏈DNA片段庫供免疫診斷使用。PCR技術(shù)對模板序列的體外擴增使目的基因的獲得較以往的基因重組技術(shù)、人工合成方式更簡捷和經(jīng)濟。如套式PCR技術(shù)中第二對引物的擴增反應(yīng)是以第一對引物的PCR產(chǎn)物為模板的，這種PCR改良技術(shù)其模板的特殊來源使PCR技術(shù)識別基因片段的敏感性和特異性都得到了提高。另外，在簡單重復(fù)序列錨定PCR技術(shù)里， 由于采用了廣泛存在于高等生物基因組中的微衛(wèi)星DNA作為擴增模板，使得PCR擴增的微衛(wèi)星標志用于構(gòu)建遺傳學(xué)圖譜更方便。[NextPage]
二、各種PCR改良技術(shù)及用途
1、任意引物PCR 在進行生物種、株、生物型、種群及個體間鑒定和區(qū)分時，任意引物PCR(Arbitrarily primed PCR，ad-PCR)技術(shù)的運用優(yōu)于限制性片段長度多態(tài)(RFLP)分析和普通PCR技術(shù)，因為PFLP分析時需要Southern blotting雜交費時費力，而PCR進行基因多態(tài)分析時需要預(yù)知靶DNA的核苷酸序列，以設(shè)計合成特異的擴增引物，為此都限制了這兩種方法在基因圖譜分析中的應(yīng)用。AP-PCR卻以一條單一的、由少數(shù)堿基組成的隨機核苷酸序列作引物，對基因組DNA進行隨機的PCR擴增，這些引物設(shè)計并不需要特異的核苷酸序列信息，且該引物可在1 個或多個位點與基因組DNA互補結(jié)合，導(dǎo)致中介未知區(qū)域的擴增，所擴增的DNA 片段在不同物種間顯示不同的隨機擴增多態(tài)性DNA(PAPD)帶型用于鑒定區(qū)分。RAPD 資料還可作為基因標志進行基因圖譜分析，多個隨機引物對同一標本基因組DNA進行擴增的RAPD資料，通過適宜的統(tǒng)計分析能夠提供更多的有關(guān)系統(tǒng)發(fā)生、親緣關(guān)系之類的信息。但為了保證RAPD資料在分類研究、作為基因標志用于基因圖譜分析時具有實用意義，則必須在所用引物、DNA多聚酶、反應(yīng)條件等方面保持穩(wěn)定，才能維護RAPD指紋圖的可重復(fù)性。
2、套式PCR 由于套式PCR系統(tǒng)比一般PCR系統(tǒng)的敏感性和特異性都高，所以在進行基因片段多態(tài)分析時常被采用。與通常的單一引物對PCR不同，套式PCR 具有兩對引物，在第一對引物引導(dǎo)的擴增反應(yīng)結(jié)束后，第二對引物繼續(xù)放大第一次的擴增產(chǎn)物，這使得套式PCR比單一引物對的PCR有了更高的敏感性和特異性。諸欣平等在套式PCR技術(shù)里采用兩對特異于R2區(qū)的引物，以檢測惡性瘧原蟲富谷氨酸蛋白基因片段的多態(tài)，作為鑒別惡性瘧原蟲不同基因株的依據(jù)，所檢出的290 個基因株為來自泰國的154份惡性瘧感染血樣，從而表明泰國惡性瘧原蟲分離株常為多克隆組成，也為惡性瘧原蟲克隆株的檢測提供了敏感的技術(shù)方法。而Manoj及Grobusch 在檢測惡性瘧原蟲基因多態(tài)時，又對套式PCR系統(tǒng)中引物做了大膽的設(shè)計，他們均在套式PCR系統(tǒng)中第二對引物的3′末端做了堿基替換，且所建立的突變特異PCR( Mutation SpecificPCR)和等位基因特異PCR(Allele Specific PCR) 對惡性瘧原蟲基因片段經(jīng)過兩輪PCR擴增后，所得到的新核苷酸序列是快速、特異識別基因存在固定多態(tài)的基礎(chǔ)。如Manoj在對惡性瘧原蟲二氫葉酸還原酶基因片段進行多態(tài)分析時所介紹的MS-PCR 套式系統(tǒng)，對該基因的722bp的片段進行第一輪PCR 擴增后， 第二對引物的反向引物‘F/’的3′末端以堿基替換方式制造出一個限制性內(nèi)切酶位點(Dral)，該位點含編碼異亮氨基酸密碼突變形式，所以套式PCR產(chǎn)物能被Dral酶切時即證明基因片段為編碼異亮氨酸密碼突變形式。為了確保限制性片段長度多態(tài)分析的可靠性，在RFLP 階段需要設(shè)置不同的對照，且RFLP是證實MS-PCR 所擴增基因片段含點突變形式不可缺省的步驟。而Grobusch等在對惡性瘧原蟲多藥抗性基因1[Pfmdr1] 片段進行多態(tài)分析時，所采用的AS-PCR半套式系統(tǒng)，對該基因的329bp片段進行第一輪PCR擴增后， 在內(nèi)引物的正向引物3′末端經(jīng)過堿基替換產(chǎn)生TAT 序列，由此引導(dǎo)的第二輪PCR， 擴增出329bp片段中含酪氨酸編碼的序列，從而能以半套式PCR產(chǎn)物是否存在，直接判定該位點的等位形式，即簡化了對PCR擴增產(chǎn)物進一步分析的環(huán)節(jié)。
PCR技術(shù)常用于檢測DNA及識別基因多態(tài)，且有極高的敏感性，但單純PCR 結(jié)果分析有難度，且所能揭示的基因信息有限。為了增強PCR技術(shù)的功能，常將PCR系統(tǒng)與別的技術(shù)系統(tǒng)有機組合，以充分發(fā)揮PCR技術(shù)體外擴增基因時的特異性強、高效的優(yōu)勢。[NextPage]
3、免疫-PCR技術(shù) 為了對微量抗原及細胞表面抗原進行檢測，將抗原抗體反應(yīng)的特異性與PCR的高度敏感性結(jié)合構(gòu)成了免疫-PCR技術(shù)。該技術(shù)的關(guān)鍵在于形成抗體-標記DNA偶聯(lián)物，在實驗中只需數(shù)百個抗原分子，經(jīng)PCR放大后即可被檢測，甚至在理論上可檢測到1至數(shù)個抗原分子。這種靈敏度使免疫檢測技術(shù)達到了一個新的高度。免疫-PCR主要由兩個部分組成，第一部分是類似于普通酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)的抗原抗體反應(yīng)。第二部分即常規(guī)的PCR擴增和電泳檢測。免疫-PCR與ELISA的區(qū)別就在于ELISA是以堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶來標記抗體，用顏色反應(yīng)來表明陽性或陰性結(jié)果；而免疫-PCR則是以一段特定的雙鏈或單鏈DNA來標記抗體，用PCR擴增抗體所連接的DNA，并對其進行電泳檢測，因此是由PCR產(chǎn)物的量來反映抗原分子的量。故免疫-PCR的關(guān)鍵之處就在于用一個連接分子將一段特定的DNA連接到抗體上，在抗原和DNA之間建立相對應(yīng)關(guān)系，從而將對蛋白的檢測轉(zhuǎn)變成對核酸的檢測，且由于預(yù)先將抗體和標記DNA偶聯(lián)，標記物及引物DNA又被設(shè)計為帶有親和配體，所以免疫PCR 技術(shù)既簡化了實驗操作又能獲得高特異敏感的實驗結(jié)果。如最初由Tskeshi 等建立的免疫PCR系統(tǒng)里，puc19標記DNA帶有生物素， 鏈親和素- 蛋白A 嵌合體既能與生物素化puc19結(jié)合，又能與固定在微滴定板上的抗原抗體復(fù)合物的抗體結(jié)合，對puc19的雙鏈DNA進行PCR擴增、產(chǎn)物分析就可推知抗原-抗體反應(yīng)的量，它可檢測到600 個牛血清白蛋白抗原分子，其敏感度是堿性磷酸酶作為標記物ELISA方法105倍。但Sano 免疫PCR系統(tǒng)里要用待測抗原包被于固體微滴定板上，所以不適應(yīng)臨床標本和難以吸附固相抗原的檢測，且鏈親和素未商品化及與生物素的結(jié)合由于其四價特性可導(dǎo)致多種生物素與親和素結(jié)構(gòu)模式，而降低整個免疫PCR方法的敏感性，為此Hendrickson等用異雙功能化學(xué)交聯(lián)劑預(yù)先將抗體和ssDNA標記連接，以形成標記DNA-抗體偶聯(lián)物，特別是他們建立了一種新的、基于雙抗夾心免疫模式的免疫-PCR，并用標上特異DNA序列的不同抗體同時檢測多種抗原， 避免了免疫實驗敏感性不足和在一個實驗中檢測抗原種類的局限，而且免疫PCR夾心模式可類似于常規(guī)的免疫實驗操作，這就使得免疫PCR技術(shù)更適用。隨著免疫PCR技術(shù)中適合標記物的不斷產(chǎn)生、引物設(shè)計的更加合理等環(huán)節(jié)的優(yōu)化，免疫PCR的功能將得到更充分的發(fā)展。
4、PCR-ELTSA 在進行致病因子檢測時可通過顯微鏡直接檢出病原體， 單克隆抗體檢測病原體特異蛋白，DNA探針及PCR技術(shù)檢測其遺傳物質(zhì)，但每種方法除適用于不同領(lǐng)域的診斷外，其自身技術(shù)系統(tǒng)也存在不足。如敏感性局限，需使用同位素，難以對大量樣本進行即時診斷等問題。將高度敏感性的PCR 與酶底物顯色系統(tǒng)結(jié)合構(gòu)成的PCR-ELISA技術(shù)，可即時對大量樣本進行特異而且敏感的病原體檢測。該技術(shù)系統(tǒng)內(nèi)特異性DNA探針的設(shè)置是保證PCR-ELISA敏感和特異的關(guān)鍵，因為PCR-ELISA的兩個組成部分：常規(guī)的PCR擴增系統(tǒng)和類似酶聯(lián)免疫吸附法顯色系統(tǒng)是由它聯(lián)結(jié)的。通常，引導(dǎo)PCR擴增的引物用生物素標記，經(jīng)PCR擴增的待測病原體DNA，其PCR產(chǎn)物上帶有生物素，能結(jié)合到業(yè)已包被于固體微滴定板上的親和素，經(jīng)堿變性后，PCR產(chǎn)物解鏈與標記有熒光素的特異探針產(chǎn)生雜交雙鏈，再用標記有辣根過氧化物酶或磷酸酶的抗熒光素抗體與熒光素結(jié)合，加合適底物后即可產(chǎn)生顯色反應(yīng)，其反應(yīng)強度經(jīng)測OD值計算。由于PCR-ELISA技術(shù)的特異性遵循DNA分子雜交時的堿基配對關(guān)系，所以PCR反應(yīng)有可能導(dǎo)致非特異性DNA片段被套擴增，但由于在ELISA系統(tǒng)中尚有特異性探針與PCR產(chǎn)物的雜交反應(yīng)，從而保證了PCR-ELISA技術(shù)高度的特異性。張龍興等用PCR-ELISA 技術(shù)建立了對惡性瘧原蟲(P.f)和間日瘧原蟲(P.v) 的鑒別診斷系統(tǒng)， 根據(jù)P. f 和P.vSSUrRNA基因序列中瘧原蟲種特異保守序列設(shè)計合成了一對通用引物，并在反向引物5′末端偶聯(lián)上生物素，所用寡核苷酸探針分別為P.f和P.v特異，并在5′末端偶聯(lián)上熒光素，經(jīng)PCR-ELISA試驗檢測兩種瘧原蟲未發(fā)生交叉反應(yīng)，敏感性較PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測高，可達4個原蟲/ul(P.f)和10個原蟲/ul(P.v)。雖然ELISA 方法定量PCR擴增產(chǎn)物結(jié)果具有更高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，但必須對寡核苷酸探針的長度、 濃度、 PCR 的擴增條件及DNA 雜交環(huán)境的質(zhì)量做嚴格控制， 為此也才能使PCR-ELISA易于自動化操作和臨床檢測使用。[NextPage]
5、差異展示PCR及DNA示差分析技術(shù) 為了分析細胞在增殖、 分化及對外界刺激反應(yīng)過程中某些特殊基因的表達，可以通過比較細胞在不同狀態(tài)及不同分化階段基因表達的差異，來發(fā)現(xiàn)新的分化表達基因。 以PCR 擴增為基礎(chǔ)建立的差異展示PCR( Differential Display PCR， DDPCR) 及DNA 示差分析技術(shù)( Representation Difference Analysis，RDA)正是以反向生物學(xué)原理發(fā)現(xiàn)差異表達新基因的技術(shù)。基于隨機引物放大原理，用PCR技術(shù)以對照組和實驗組細胞的全部mRNA為模板合成兩組cDNA，通過兩組細胞的cDNA的平行測序電泳，以分析比較兩組細胞cDNA的差異，從凝膠中分離差異區(qū)帶及提取cDNA作進一步分析。 DDPCPR較以建立減數(shù)文庫再雜交、篩選差異新基因方法更快速有效，且應(yīng)用這種方法已經(jīng)克隆了一些重要的基因，如在血管損傷時特異轉(zhuǎn)錄的組織膜蛋白基因BART1，在人肺癌細胞中高表達的新基因N8。但這一技術(shù)在應(yīng)用中也越來越暴露其不足，其中最明顯的缺點就是假陽性率高，且由于是對細胞全體RNA作放大，工作針對性差。隨后發(fā)展建立的RDA技術(shù)將減數(shù)雜交與PCR有機結(jié)合，首先提取對照組和實驗組細胞總RNA，并提純mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶得cDNA 建立對照組與實驗組兩個基因文庫，用內(nèi)切酶分別消化兩組cDNA，然后將實驗組文庫的5 ′末端接上設(shè)計的寡核苷酸鏈，將實驗組DNA與對照組DNA按1:100的比例混合，經(jīng)變性再復(fù)性后，只有來自實驗組的自我復(fù)性差異分子的雙鏈DNA5′末端含修飾物寡核苷酸鏈，通過補平所有雙鏈3′端，采用互補于寡核苷酸序列的引物，經(jīng)PCR將兩端均含寡核苷酸鏈的差異DNA 雙鏈分子以指數(shù)級放大。對照組與實驗組同源的基因片段可形成DNA雙鏈雜交分子，但只有單末端含寡核苷酸鏈，故經(jīng)PCR擴增后只成線性放大，最后通過電泳分析，將占優(yōu)勢的差異分子克隆到載體上即可獲得新分子基因及功能，采用RDA技術(shù)已有多處中分化差異表達基因片段及未知DNA片段被克隆測序，如從前B細胞系中克隆到6 個受咖啡因影響的特異性上調(diào)表達的基因。Lewis在篩選受C-myc上調(diào)和下調(diào)表達的基因時，共獲得20 個差異表達片段，其中5個經(jīng)測序證實為未知基因。總之，PDA為克隆新基因提供了特異性強、快速有效的方法，且由于是通過特異放大分化差異基因片段，所以對新基因的發(fā)現(xiàn)更靈敏，隨著該技術(shù)在實際應(yīng)用中不斷完善、發(fā)展，一定會有助于生命科學(xué)的研究。
在四基點突變檢測時， PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)也是靈敏的，通常單個核苷酸差異的DNA片段經(jīng)SSCP能被檢出。SSCP是將PCR產(chǎn)物變性成單鏈DNA片段，用分辯高的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離不同泳動速率的單鏈DNA，由于單鏈NDA內(nèi)堿基的改變，會形成不同于原有堿基組成時的空間結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為單鏈構(gòu)象多態(tài)，不同構(gòu)象DNA分子在電泳時速率即不一樣。所以在已知基因序列信息情況下，設(shè)計特異引物引導(dǎo)完成SSCP技術(shù)適于檢測生物DNA多態(tài)。朱乃碩等在對中國人CTLA-4基因V區(qū)進行多態(tài)研究時，經(jīng)DNA 序列分析得中國人細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)的V區(qū)與國外報道在兩個位點存在差異，即第54位密碼子中國人為編碼甲硫氨(ATG)，第110位密碼子處為編碼蘇氨酸(ACC)，且經(jīng)過SSCP對CT-LA-4的擴增產(chǎn)物的分析也證實，中國人與外國人間V區(qū)基因存在多態(tài)，中國人該區(qū)呈高度保守性。
總之，PCR技術(shù)在體外擴增基因時的高敏感性、特異性和高效性使得基因重組、基因研究的針對性更強；而以PCR為基礎(chǔ)，同時與恰當(dāng)?shù)募夹g(shù)匹配則使得PCR技術(shù)更具生命力，并且這也將是PCR技術(shù)的展趨勢。
參考文獻略
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