瘧疾疫苗研究概況
時間：2005-05-11
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董瑩 云南省瘧疾防治研究所 云南思茅 665000
全文發(fā)表于《中國寄生蟲病防治雜志》2000年第13卷第3期217-220頁
目前瘧疾仍是嚴重危害人類健康的熱帶傳染病，據(jù)WHO近5年的統(tǒng)計，每年平均約有2.1億人發(fā)病，100多萬人死于瘧疾，世界上有100多個國家有瘧疾流行，這些國家中一半的人口生活在瘧區(qū)，熱帶非洲國家的人群瘧疾發(fā)病率均呈上升趨勢。而瘧原蟲抗藥性及蚊媒耐藥性的產(chǎn)生和迅速擴散，給瘧疾的控制帶來了更大的難度，似乎我們已經(jīng)不可能指望采取單一的措施便能降服一種由生活史復雜、抗原高度變異的瘧原蟲引起的傳染病。瘧疾疫苗的研制和運用可為瘧疾的綜合治理提供有力的武器，但對瘧原蟲免疫機制的膚淺認識及缺乏適當?shù)膭游锬Ｐ停沟糜行У呐R床瘧疾疫苗在經(jīng)歷半個世紀后的今天仍是鳳毛鱗角。不過隨著分子生物學技術(shù)的提高和分子免疫學研究的深入，瘧疾疫苗已步入核酸疫苗時代，約氏瘧原蟲核酸疫苗的問世及顯示對68%小鼠具有保護作用的結(jié)果，極大地鼓舞了瘧疾疫苗的研究者。本文依據(jù)瘧疾疫苗的發(fā)展，簡介幾種重要的瘧疾候選疫苗及其作用機理， 并簡述對影響瘧疾疫苗效果的相關(guān)因素。
一、瘧疾疫苗及其作用機理
1、子孢子疫苗 最早的瘧疾疫苗是采用瘧原蟲死疫苗或x射線減毒的子孢子活疫苗，這種疫苗雖然曾獲得一定的保護性，甚至可刺激機體產(chǎn)生細胞毒性T淋巴細胞，即誘導機體產(chǎn)生對瘧原蟲全面的保護性免疫應答。但該類疫苗接種時可引起免疫抑制，減毒不充分導致臨床感染，減毒過程可使疫苗效價降低，且有毒力回復危險，另外瘧原蟲來源又困難。為此該類瘧疾疫苗不曾在瘧疾疫苗發(fā)展史中留有一席之地，但它的確是開了瘧疾疫苗研制的先河而被載入史冊。
2、單價分子─亞單位疫苗
（1）、紅細胞前期疫苗 抗子孢子疫苗的研究主要集中在對瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白(CSP) 的運用。CSP分子量約40～60kDa，是一種覆蓋于成熟子孢子表面的一層表被蛋白，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所有不同種屬的瘧原蟲都有該蛋白存在，其中央1/3為重復序列區(qū)，不同種屬的瘧原蟲重復區(qū)域的長度、氨基酸組成以及重復次數(shù)均有所不同，免疫活性也有很大差異，在惡性瘧原蟲該重復四肽為天冬酰胺-丙氨酸-天冬酰按-脯氨酸(Asn-Ala-Asn-Pro，NANP)。整個分子的CSP 與AL(OH)3佐劑免疫20個志愿者，(NANP)19免疫13名成年人，可檢測到特異抗體或抗體水平增加，甚至淋巴細胞增殖增加，環(huán)化的(NANP)3誘生的多克隆抗體均可與原蟲反應，表明有潛在的保護性。環(huán)子孢子抗原的疫苗正在岡比亞進行試驗。
惡性瘧原蟲CSP的(NANP)n重復區(qū)內(nèi)外含有B細胞表位，這些B細胞表位在CSP 誘導的免疫應答中起重要作用，常能直接激活B細胞。從CSP上還鑒定出T細胞位點CS- T3位于分子的378～398氨基酸之間，在惡性瘧原蟲不同株間該序列相對保守，且該點能與大多數(shù)主要組織相容性復合體(MHC)分子結(jié)合，被多種不同基因型的人和小鼠TH識別，即CS-T3肽能克服MHC限制性，實驗證實CS-T3肽交聯(lián)直接免疫7個不同基因型小鼠全部產(chǎn)生了抗子孢子抗體。
抗子孢子疫苗誘生的特異性抗體能防止肝細胞感染或防止原蟲在肝內(nèi)發(fā)育，一般認為若該類疫苗對預防原蟲感染有任何作用，必然具有很高的效能。因為一只感染蚊的唾液腺常含有幾千個子孢子，而每個子孢子能感染一個肝細胞，多數(shù)人被一只感染蚊叮咬后，接種的子孢子是很少的，所以一個地區(qū)若昆蟲接種率很低，則使用該類疫苗可有效降低瘧疾發(fā)病率，但反之保護力是不能保證的。[NextPage]
（2）、紅細胞內(nèi)期疫苗 該期的疫苗候選抗原常以多價的形式存在， 主要包括對NSA1、MSA2和RESA、HSP等保護性抗原的運用，其免疫原性、保護作用在動物均得到證實。
MSA1為裂殖子主要表面抗原前體，在裂子體期合成，分子量為180～220kDa。MSA1分子在不同種瘧原蟲有不同的多態(tài)性，其氨基端為信號肽與一個短的可變重復區(qū)相連，該重復區(qū)常稱為MSA1R2，表現(xiàn)為高度變異，其串聯(lián)重復的三肽SXX在不同株重復數(shù)不同，個別株有缺乏，羧基端為疏水跨膜區(qū)，并包含兩個表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)，且位于MSA1加工產(chǎn)物19kDa片段內(nèi)，該片段在裂殖子侵入紅細胞時仍留于紅細胞膜表面。針對該19kDa的數(shù)個單克隆抗體可以明顯抑制裂殖子入侵紅細胞，且只包含表皮生長因子樣的區(qū)域所誘生的特異抗體也可在體外抑制瘧原蟲生長。研究較多的是以NSA1分子或其免疫活性亞單位為基礎(chǔ)構(gòu)建融合蛋白或多價亞單位疫苗，如把含有多個B細胞及T細胞表位的MSA1與RESA雜合，免疫小鼠中有明顯的抗體反應及淋巴細胞增殖反應，對約氏瘧原蟲有部分保護作用。基于MSA1的血液期人類疫苗正在巴布亞新幾內(nèi)亞進行現(xiàn)場試驗。
從MSA1獲得gp190多肽含有至少2個B細胞表位及3個T細胞表位，其中T細胞表位可與多種MHCⅠ分子結(jié)合，即MHC并不對裂殖子抗原產(chǎn)生限制作用。實驗也證明用該肽刺激瘧疾病人外周血淋巴細胞發(fā)生增殖。抗MSA1抗體抑制裂殖子侵入紅細胞將會降低原蟲密度，而寄生蟲密度又與疾病的嚴重性有關(guān)，特別是在無免疫力人群。所以NSA1誘導的機體保護性免疫有利降低瘧疾嚴重病例的發(fā)生。
MSA2是裂殖子的另一種表面抗原，與MSA1無關(guān)，分子量為45kDa。MSA2分子中間為重復單位結(jié)構(gòu)，其重復數(shù)量、長度和序列多變，且免疫原性強，可誘發(fā)高滴度抗體，該特異抗體與惡性瘧原蟲、夏氏瘧原蟲可起免疫反應。該可變區(qū)也包含有激活B細胞及T細胞的表位，提示本身也具有克服MHC限制的能力，可作為疫苗候選抗原。
RESA是環(huán)狀體感染的紅細胞表面抗原，為成熟裂殖體合成的一種分子量為55kDa 的裂殖子主要蛋白，它首先聚集于裂殖體微線體上， 在裂殖子入侵紅細胞過程中或侵入后不久釋放并滯留于感染紅細胞表面，此抗原在惡性瘧原蟲的不同蟲株間均表現(xiàn)出很強的相似性，且能激起高水平免疫應答。特別位于該蛋白分子的氨基端及羧基端的重復序列結(jié)構(gòu)，具有很強的免疫原活性， 如直接用羧基端重復序列刺激瘧區(qū)居民外周血淋巴細胞發(fā)生增殖增強并釋放IFN。B細胞表位多分布在如此的重復序列內(nèi)。RESA誘導的T細胞反應與多種MHC 基因型間無甚關(guān)系，初步認為MHC對RESA特異性免疫應答的調(diào)節(jié)作用微弱。
以上3種血液期抗原的實驗室疫苗，正在巴布亞新幾內(nèi)亞進行現(xiàn)場試驗。但更多的是以這3種保護性抗原的免疫活性部分構(gòu)建多價亞單位疫苗，如惡性瘧的Pfs66疫苗。[NextPage]
（3）、抗傳播疫苗 由于瘧原蟲在配子體期表達特異蛋白Pfs48/45，當特異蛋白暴露于機體免疫系統(tǒng)所誘生的特異抗體能阻止配子受精及合子的發(fā)育，如體外證實，抗配子體期特異蛋白的抗血清可抑制合子向動合子轉(zhuǎn)變及動合子的成熟。所以該類疫苗雖無直接保護作用，但卻可降低瘧疾傳播。不過阻斷作用很大程度上還與當?shù)丿懠矀鞑ニ接嘘P(guān)，一般昆蟲接種率(EIR)低的地區(qū)阻斷作用更肯定些。
3、多價亞單位疫苗
（1）、化學合成復合多價疫苗 因為瘧疾單疫苗的困惑，1988年P(guān)atarroyo率先人工合成了基于惡性瘧原蟲血液期疫苗候選抗原的復合多價45肽疫苗，即惡性瘧Pfs66疫苗，它是第一個成功的抗瘧疾疫苗，其45肽的構(gòu)成為惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面抗原重復序列NANP及3個來自裂殖子表面抗原的多肽Pfs35.1、Pfs55.1及Pfs83.1，且Pfs66疫苗為該45肽的多聚物及單體的混合，抗該肽的抗體可抑制體外活子孢子入侵肝細胞、體外裂殖子入侵RBC、蚊體中卵襄的發(fā)育，提示該疫苗對惡性瘧的各期都可能有效。惡性瘧Pfs66自誕生起，已經(jīng)過無數(shù)次的動物試驗及不同瘧疾流行地區(qū)人群接種試驗，其中于1992年P(guān)atarroyo 本人在哥倫比亞進行的一次小規(guī)格臨床試驗其結(jié)果最理想，推算該疫苗對惡性瘧保護有效率為82.7%，該水平已高于WHO免疫推廣計劃(EPI)的規(guī)定，即80%的有效率為有效疫苗的標準，其余的臨床實驗均未達到這個標準，而最近在泰國人群眾所做的試驗結(jié)果顯示Pfs66疫苗接種對惡性瘧無保護作用。patarroyo多價疫苗在實驗中之所以保護作用不定，其原因是多方面的，Pfs66 疫苗化學組成的微小變化可導致試驗結(jié)果不一，各地區(qū)免疫人群對瘧原蟲的暴露程度不同及瘧原蟲株間的基因變異直接影響免疫保護能力和免疫應答水平，加之Pfs66疫苗的免疫原性有限。盡管對Pfs66疫苗的效果評價還未終止，但Pfs66疫苗的思路一直貫穿于亞單位疫苗的研制中。
（2）、基因工程多價疫苗 由于化學合成多肽費用很高，限制了Patarroyo的Pfs66 疫苗的規(guī)模應用，為了優(yōu)化Pfs66疫苗45肽的免疫原性及生產(chǎn)過程，國內(nèi)外先后用45肽基因與外源性T細胞點位基因融合，如用MSA1、MSA2、RESA內(nèi)的T細胞位點與IL-1，破傷風外毒素TT的T細胞位點基因融合并在大腸桿菌表達，已初步證實原核細胞表達的該融合蛋白能與小鼠抗惡性瘧原蟲紅內(nèi)期抗原的抗體發(fā)生特異免疫反應；另外也有通過重塑抗原短肽空間結(jié)構(gòu)來改善抗原免疫活性的，如用HBsAg/45肽融合蛋白，由于45肽抗原活性表位處于HBsAG顆粒表面得以構(gòu)成近似該表位的天然空間結(jié)構(gòu)，從而有助于增強抗原免疫活性。用該融合蛋白誘導動物產(chǎn)生高水平的抗瘧抗體；而以突出多階段保護的重組疫苗研究，如將CSP基因、MSA1基因、MSA2基因、RESA基因全面融合并原核細胞表達得融合蛋白作為瘧疾多價疫苗的候選物。或直接將以上4種保護性抗原的T細胞/B細胞表位基因重組原核細胞表達。這些疫苗候選抗原的保護性免疫原性正在研究中。
4、基因工程減毒活疫苗 由于基因工程疫苗的生產(chǎn)，除去基因方面的操作，基因表達產(chǎn)物的分離、純化過程很繁瑣，從而也阻礙了瘧疾基因工程疫苗的開發(fā)利用。減毒沙門氏菌作為重組基因的攜帶載體，可使重組基因的表達產(chǎn)物直接暴露于機體的免疫系統(tǒng)，而省卻了上述的繁瑣。這得力于減毒沙門氏菌可表達外源性抗原基因的能力，而口服后可寄生在體內(nèi)， 所以可持久將異源抗原暴露于機體免疫系統(tǒng)，從而激發(fā)免疫應答， 且包括對機體細胞免疫的激活。Sadoff等將伯氏瘧原蟲CSP基因克隆到含噬面體啟動子的質(zhì)粒，所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化鼠獲得抵抗子孢子攻擊的能力。含絲氨酸重復蛋白基因和富組氨酸蛋白Ⅱ基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化SR-Ⅱ減傷寒桿菌毒株，并將其接種BACB/C鼠毒沙門氏菌株，免疫動物后也測得特異于上兩種瘧原蟲抗原的IgM抗體。盡管抗原基因重組質(zhì)粒可由減毒沙門氏菌株介導在機體內(nèi)直接表達而降低抗原受MHC Ⅰ的限制性，隨之產(chǎn)生的特異細胞毒作用也加強了機體的免疫應答水平，但這種方法中，質(zhì)粒的選擇、重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化菌株內(nèi)的丟失及轉(zhuǎn)移至其它菌株等問題的存在， 在臨床應用仍有差距。[NextPage]
5、核酸疫苗 核酸疫苗徹底簡化了基因工程蛋白疫苗的產(chǎn)生過程，而與基因工程減毒活疫苗有異曲同功之處：將抗原基因直接在機體表達，但卻優(yōu)于后者，核酸疫苗中不再需要生物作為載體，而是將含抗原基因的重組真核質(zhì)粒直接接種于轉(zhuǎn)染效力高，呈遞抗原能力強的組織，而于此表達出已經(jīng)水解、修飾空間構(gòu)象幾近天然的抗原蛋白。若抗原物質(zhì)在APC 表達則與MHC I結(jié)合后可激活CTL產(chǎn)生細胞免疫；若抗原來源于其它細胞表達而被APC處理與MHC I結(jié)合則能激活TH細胞產(chǎn)生體液免疫。Hoffman等用含約氏瘧原蟲的特異性抗體和CTL反應，兩種反應水平均高于減毒子的免疫，且顯示對子孢子攻擊小鼠有68%被保護。最近，一種復合價DNA疫苗，將惡性瘧原蟲不同發(fā)育時期的保護性抗原(CSP、PFSSP2、LSA1、MSP1、SETA、AMA1和Pfs25)基因重量組到高度減毒的牛痘病毒NYVAC基因組中，并將重組真核質(zhì)粒接種猴，結(jié)果表明，該實驗室疫苗安全、能誘導特異抗體產(chǎn)生，并已進入臨床實驗；國內(nèi)李學榮等將含紅細胞前，內(nèi)期多個保護性抗原的基因重組入真核表達質(zhì)粒得PcDNA3-Pf8，直接免疫BALB/c小鼠，檢測到特異抗體存在，且所得免疫血清在體外能抑制惡性瘧原蟲生長、發(fā)育。盡管核酸疫苗在抗原目的基因、真核質(zhì)粒選擇方面有更多要求，如質(zhì)粒的非復制性，對宿主DNA的非整合性，要求精確的接種途徑及劑量，且核酸疫苗仍需要免疫佐劑，但核酸疫苗卻以其眾多的優(yōu)點，如生產(chǎn)簡便、成本低廉、穩(wěn)定性好、安全、抗原免疫原性強、能誘導機體對抗原的細胞一體液免疫應答、免疫持久等而立足于瘧疾疫苗領(lǐng)域，且發(fā)展?jié)摿薮螅钳懠惨呙绲男孪Ｍ?o:p>
二、影響瘧疾疫苗效果的因素
1、蛋白載體化學合成及基因工程亞單位疫苗內(nèi)有抗原活性的表位常呈不具天然構(gòu)象的短肽，這樣的短肽難以誘導機體產(chǎn)生免疫應答，為增強其免疫活性，一般將抗原活性表位連于一蛋白載體，其目的在于(1)蛋白載體的存在可重塑抗原活性短肽的天然構(gòu)象，如HBsAg/45肽融合蛋白，HBsAg顆粒將保護性瘧疾抗原表位45肽呈現(xiàn)于顆粒表面，因形成了免疫活性區(qū)而具有很強的免疫原性；(2)蛋白載體帶有外源性T細胞表位，這些表位與抗原活性表位聯(lián)合共同誘導機體的免疫應答，如將CSP的(NANP)3連接到破傷風類毒素上形成的融合蛋白作為瘧疾疫苗的候選抗原，可誘導機體產(chǎn)生抗子孢子抗體。
2、免疫佐劑對分子─亞單位疫苗采用蛋白載體以增強保護性抗原的免疫活性的同時，尚可運用佐劑的非特異性作用增強抗原的免疫原性和反應原性。但具體選擇何種佐劑尚需仔細斟酌。傳統(tǒng)的福氏佐劑能提高機體對寄生蟲的免疫力，但只適宜動物使用， 鋁鹽可應用于人體，但佐劑作用不強，且難于激發(fā)細胞免疫，胞壁酰二肽(MDP)可提高細胞免疫水平，白細胞介素-2及TNF等細胞因子、脂質(zhì)體除具有佐劑作用尚有免疫增強作用，它們與特異的保護性抗原合用能增強特異性免疫應答水平。
3、遺傳變異 影響瘧疾疫苗有效性的遺傳因素， 包括來自免疫接種的機體及瘧原蟲兩方面。已證實機體免疫應答基因的多態(tài)性對瘧疾的易感性起作用，特定的Ⅰ、Ⅱ類HLA 等位因基與腦型瘧和嚴重瘧疾貧血不發(fā)生有關(guān)。并且機體對瘧原蟲抗原的免疫應答也受MHC分子對瘧原蟲抗原識別的復制能被大多數(shù)MHC分子識別，不受MHC明顯瘧原蟲保護性抗原才有能力作為瘧疾疫苗的候選抗原，為此現(xiàn)在的疫苗抗原設計中，以連接外源T細胞表位來降低機體免疫應答基因?qū)σ呙绲南拗菩裕鰪姍C體對疫苗的免疫應答水的免疫逃避，瘧疾疫苗的免疫保護不普遍，所以瘧原蟲種、株間的共同保護性抗原表位是構(gòu)建瘧疾疫苗候選抗原的基礎(chǔ)。[NextPage]
4、候選疫苗的保護性預測 雖然當前的候選免疫原可經(jīng)過抗原活性表位鑒定及對這些表位基因的基因重組獲得，且一般靶表位沒有或極少多態(tài)性，但這些候選疫苗有時不得不在缺乏了解其保護作用機制、缺乏恰當?shù)臋z測方法對保護性效果進行預測的情況下，就作的現(xiàn)場試驗，這往往導致瘧疾研究有限資金的浪費；另外體外檢測候選疫苗的保護性免疫，常采用免疫接種小鼠和猴，以其血清抗體水平變化及外周血細胞的增殖情況進行保護性判斷，經(jīng)動物實驗所得結(jié)論推測在人體的有效性其可信度又如何呢?所以在確認候選疫苗有必要做保護性預測的同時，發(fā)展對有效的保護性檢測方法也是重要的， 如在體外用免疫血清作阻斷瘧原蟲入侵RBC實驗以檢測候選疫苗誘導的體液免疫可能的保護作用。
三、瘧疾疫苗研究的復雜性
瘧疾疫苗常以若干瘧原蟲候選抗原來建立，惡性瘧原蟲已被鑒定的40 多種瘧疾抗原中MSA1、MSA2、RESA、CSP、HSP和Psf48/45 等保護性抗原常被用作不同類型瘧疾疫苗的候選抗原，但以它們?yōu)榛A(chǔ)重組的多價亞單位疫苗候選物常不是高效的，其原因可能是每種不同的抗原是通過不同的機制發(fā)揮保護作用，通過不同的途徑被呈遞，為此疫苗成分間存在干擾，而獲得多價高效瘧疾疫苗的機率就有限。
一種候選疫苗必須從一系列體內(nèi)、體外模型實驗中獲得必要的信息，如保護性程度，但目前仍不能通過動物模型直接評估候選疫苗的保護作用。因為人與動物間存在著機制差異及瘧原蟲對宿主也有極嚴格選擇性的限制。
另外，瘧疾疫苗作為外來力量會破壞幾百萬年來瘧原蟲與人宿主之間在自殺選擇下建立的平衡，如干擾了天然免疫的發(fā)展，一旦停止使用疫苗，會留下大量的易感人群，誘發(fā)免疫耐受等負面作用，因此，在瘧疾流行區(qū)人群使用瘧疾疫苗的可行性是必須首先論證的。旅游者或士兵使用瘧疾疫苗可降低瘧疾發(fā)生，但目前仍沒有一種疫苗的保護性是明顯的。
所以，瘧疾保護性臨床疫苗的問世已迫在眉睫， 但對它的研制更應建立在對瘧疾免疫機制深刻認識的基礎(chǔ)上，建立在對瘧原蟲分子結(jié)構(gòu)與功能更全面認識的基礎(chǔ)上，另外，還必須確立瘧疾疫苗在瘧疾綜合治理中的地位以便一些有價值的瘧疾實驗室疫苗盡早發(fā)揮應有的作用。
參考文獻略
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